תקציר מערכת אבחנתית פותחה לשם ניטור נוכחות של חיידק מזון גורם מחלות, Listeria monocytogenes . התפרצויות חוזרות ונשנות של מחלת הליסטריוזיס יצרו חקיקה נוקשה הדורשת מערכות אבחון טובות יותר המסוגלות לגלות נוכחות חיידק זה בדוגמאות מזון. המבחנים הקיימים כיום מסתמכים על שיטות קלאסיות של גידול וזריעה על גבי צלחות פטרי, בד"כ בשילוב של היברידיזציה של דנ"א או PCR. זמן מינימאלי של 48
שעות נדרש לשם השגת תוצאות, ולכן אילוץ זה של זמן דורש מציאת פתרונות חלופיים אשר יתנו רגישות גבוהה, קלות ביצוע יחד עם אחוז גבוה לתשובה מהימנה, וכל זאת בזמן קצר ככל האפשר. מערכת אבחון זו מביאה שילוב של תחום ההנדסה הגנטית יחד עם הפרדה מגנטית מוצעת בעבודה זו.
מבחן זה מורכב משני אלמנטים, מכשיר לומינומטר המאפשר גילוי רמות אור נמוכות וערכה חד-פעמית. הערכה מחברת בין נוגדנים ייחודיים לחיידק על גבי חלקיקים מגנטים.
הנוגדנים נקשרים לחיידקים בתוך תמיסת ההעשרה, ולאחר הפרדה מגנטית הקומפלקס של חלקיק-נוגדן-חיידק מוכנסים לתוך תמיסה של בקטריופאג'ים ספציפיים לחיידק Listeria monocytogenes והמכילים גן לאנזים לוציפראז . לאחר מספר שעות נוכחות או אי נוכחות של החיידק נבדקת ע"י תהליך פליטת אור הנוצר בעקבות הוספת שני סובסטרטים, אלדהיד ארוך שרשרת וחומר כימי רב השפעה נוסף, נתרן אזידי (NaN3).בעבודה זו בחנו את המערכת כנגד דוגמאות מזון שונות.
העבודה באנגלית Table of Contents:
1
Introduction      6
1 .1 The problem        … 6
1 .2 The history of the discovery of the organism 8
1 .3 Taxonomy            … 9
1 .4 Morphology         . 10
1 .5 Ecology                . 10
1 .6 Serology              . 11
1 .7 Pathogenesis cycle –.. 13
1 .8 Virulence factors 15
1 .8.1 Adherence and invasion                                                                                                                   16
1 .8.2 Listeriolysin (LLO)                                                                                                                            17
1 .8.3 Catalase and super oxide dismutase                                                                                             18
1 .8.4 Actin Polymerization                                                                                                                        18
1 .9 Methods of detection — 19
1 .9.1   Conventional methods                                                                                                                    19
1 .9.2   Biochemical tests                                                                                                                             21
1 .9.3   ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) — 24
1 .9.4   Immuno-magnetic- separation                                                                                                    
5
1 .9.5   Molecular methods                                                                                                                         27
1 .9.6   Luciferase phage assay                                                                                                                  29
1 .9.7   Biosensors                                                                                                                                         29
1 .9.8   Method summary                                                                                                                             30
1 .9.9   Immuno-magnetic phage separation                                                                                          31
1 .9.10 The bacterial luminescence system                                                                                             32
1 .9.11 The detection of bacteria by bacteriophage recognition — 35
1 .9.12 The use of the lux system for the detection of bacteria –… 36
2 Work objectives         . 38
3 Materials and methods       -.. 39
3 .1 Materials             . 39
Chemicals                  . 39
Bacteria list                                                                                                                                                   40
3 .1.1 Medium preparation                                                                                                                         41
3 .1.2 Buffers:                                                                                                                                                43
3 .2 Work procedures 45
3 .2.1
Growth of Bacteria                                                                                                                            45
3 .2.2 Bacteriophage propagation                                                                                                            46
3 .2.3 Detection of Listeria monocytogenes using magnetic-immuno-phage assay -.. 48
3 .2.4 Listeria monocytogenes detection in food samples using the magnetic immuno-phage assay (MIPA)                     50
3 .2.5 Microscopy                                                                                                                                         51
4 Results         .. 52
4 .1 Optimization Rationale – 52
4 .1.1 Bacterial growth                                                                                                                                52
4 .1.2 Bacteriophage incubation time determination –… 53
4 .1.3 Bacteriophage titer determination                                                                                                54
4 .1.4 The effect of aldehyde on the light output -.. 55
4 .1.5 The effect of sodium azide (NaN3) on light output -.. 56
4 .1.6 The sensitivity of the system                                                                                                            57
4 .1.7 The specificity of the system                                                                                                            58
4 .2 Application of the system in real food samples — 60
4 .3 Microscopy         . 63
4 .3.1 SEM microscopy                                                                                                                                63
4 .3.2 Fluorescence microscope                                                                                                                64
5 Discussion        –.. 65
5.1 Artificially contaminated food samples -.. 66
5.2 Naturally contaminated food samples — 67
5.3 Future research 68
6 References        –.. 69