הפקת דנ”א של הפלסמיד pUC19
וטרנספורמציה בחיידקים הקורס ממנדליזם להנדסה גנטית הוא אחד הקשים באוניברסיטה הפתוחה, כמו כן רבים נאבקים עם הגשת סיכום המעבדה של קורס זה (ממ"ן 15).
העבודה שלי היא מפורטת מאוד, יסודית ומקיפה וכמו כן קיבלה ציון גבוה.
מבוא:
פלסמידים הפלסמידים הן מולקולות טבעתיות קטנות של דנ"א דו גדילי, הנמצאות בציטופלסמת החיידק, הן מכפילות את עצמן בקצב גבוה מקצב הכפלת התא המאכסן. הפלסמידים נמצאים בתא כיחידות עצמאיות ללא תלות בדנ"א הכרומוזומלי של החיידק ויכולים להגיע לעשרות עותקים. חלק מהפלסמידים מכילים גנים המקנים עמידות לתרופות אנטיביוטיות שונות ומשמשים כאמצעי זיהוי וסמני ברירה למאכסנים שקלטו את הפלסמיד.
סיכום:
במעבדה זו אפיינו את הפלסמיד pUC19 ע"י חיתוכו באנזימי הגבלה שונים ו"הרצתו" בבג'ל אגרוז. מצאנו כי ההרצה בג'ל וההכנה של עקומת הכיול מדנ"א של הפאז' l אינם מספקים לנו אורך מולקולה מדוייק של הקטע שאנו מריצים בג'ל אלה נותנת לנו רק קירוב. למשל, אורכו של הפלבמיד הוא 2,686bp ואחרי ההרצה בג'ל ואפיונו קיבלנו אורך דומה בגודלו, אך אורך לא מדוייק עד לזוג הנוקלאוטידים האחרון (3,000bp). המסקנה היא שאיפיון בג'ל אגרוז יכול להצביע על סדר גודל של מולקולה אך לא בדיוק של נוקלאוטיד.
ראינו כי הפלסמיד מכיל גן המקנה לחיידקים עמידות לאמפיצילין וכמו כן הוא מכיל חלקים מאופרון הלקטוז המאפשר לחיידקים מוטנטים המכילים אותו לנצל את הלקטוז כמקור לפחמן (מה שחיידקים לא טרנספורמנטיים לא יכולים לעשות).
הפלסמיד מכיל חוליה מקשרת המאפשרת את שיבוטם של מקצטעי דנ"א זרים לתוכו ע"י שימוש באנזימי הגבלה שונים. בעזרת האנזים EcoRI שובט לתוך הפלסמיד insert המקנה לחיידקים המכילים את הפלסמיד עמידות לתרופה האנטיביוטית קנמיצין, אולם מכיוון שהחוליה המקשרת נמצאת בתוך אתר ה- lacZ נוכחותו של ה- insert פוגעת בתעתוקו של גן זה, המקודד ליצירת b – גלקטוזידאז ופוגעת ביכולת החיידקים לנצל לקטוז כמקור פחמן. הבחנו בין גנוטיפים שונים של חיידקי E.Coli על ידי גידולם על מצעי גידול ברירניים. חיידקים המסוגלים לנצל לקטוז יצרו מושבות כחולות על גבי מצע המכיל x-gal ומושבות אדומות על גבי מצע מקונקי. כמו כן חיידקים אלו גדלו על מצע המכיל אמפיצילין ואלו שהכילו את ה- insert גדלו גם על מצע המכיל קנמיצין. בשלב הבא של המעבדה הפקנו את הפלסמיד מחיידקים המכילים אותו. על מנת להשיג מספר גדול של חיידקים ובהם מספר רב של פלסמידים יצרנו לחץ סלקציה על ידי גידולם במצע המכיל ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה. הפקנו את הפלסמיד במספר שלבים שבסופם מתרחש הרס עדין של דופן וממברנת תא החיידק וסילוק יתר מרכיבי התא.
לאחר הפקת הדנ"א הפלסמידי עשינו טרנספורמציה שלו בחיידקים קומפטנטים. וידאנו היקלטות הפלסמיד ע"י החיידקים ע"י גידולם במצעי  גידול המכילים אמפיצילין. החיידקים אשר קלטו את הפלסמיד יכלו לגדול על המצע המכיל את האמפיצילין ויצרו מושבות כחולות. (שאר החיידקים לא עמידים בפני אמפיצילין לא גדלו על המצע הבררני). מצאנו שיעילות הטרנספורמציה תלויה בריכוז הדנ"א הנמצא במצע – ככל שמחדירים יותר דנ"א כך נוצרות יותר מושבות, ז"א שיש יחס ישר בין כמות הדנ"א המוחדרת לכמות המושבות המתקבלות.