ביוכימיה א - - דוח מעבדה

סוג העבודה
מספר ממ"ן 12
מקצוע
מילות מפתח
ציון 98
שנת הגשה 2018
מספר מילים 2168

תקציר העבודה

דו"ח מעבדה – ממ"ן 12
מטרות המעבדה:
1. הפרדת הליזוזים משאר החלבונים בתמיסת המוצא ובדיקת ריכוזו הכל אחת מהדגימות שנקבל.
2. בדיקת יעילות שיטת הבידוד של הליזוזים.
3. השוואת הדגימות שקיבלנו המכילות ליזוזים מבחינת דרגת הניקוי שלהם.
שיטות וחומרים:
שיטות:
1. מחליף קטיונים – שיטה המאפשרת לנו להפריד חלבונים על פי מטענם.
לליזוזים, אותו אנו רוצים להפריד, יש PI גבוהה ביחס לשאר החלבונים ולכן הפרדה על פי שיטה זו מתאימה לנו. מחליף הקטיונים מורכב משרפים בעלי מבנה כדורי ובעלי מטען שלילי. נשתמש בתכונה הייחודית של הליזוזים וכך בPH מסויים שאר החלבונים שבתמיסה יהיה טעונים במטען שלילי ולא יקשרו לresins אך הליזוזים יהיו טעונים במטע חיובי ולכן יוכלו להיקשר אליהם. לאחר מכן נשנה את הPH כך –
חומרים:
1.     BSA 1% – חלבון אלבומין בריכוז ידוע (1% = 10 mg ב1ml). השתמשנו בו ליצירת עקומת הכיול שלנו.
2 .     עמודת CMC מורחף בבופר טריס 0.05M , pH=6.3
– השרפים בעמודה זו נקראים קרבוקסימתילצלולוז (CMC) ומורכבים מסיבי צלולוז אליהם קשורות קבוצות CH2COO-.
אל קבוצות אלו עתידים להקשר הליזוזים שלנו בקשרים אלקטרוסטטיים. חשוב לשמור את העמודה רטובה כל הזמן על מנת לאפשר יצירת קשרים אלקטרו סטטיים.
3.     בופר טריס 0.05M, pH=8.2
– בבופר זה אנו משתמשים על מנת לייצר PH בעמודה אשר בו רב החלבונים יהיו בעלי מטען שלילי (הPIשלהם נמוך מ8.2 ( וכך הם לא יקשרו לשרפים בעוד שלליזוזים יהיה מטען חיובי (הPI שלהם הוא 10.5- גדול מ8.2).
4.     בופר קרבונט 0.2M, pH=10.5
– לאחר שהזרמנו את תמיסת המוצא ב 8.2=PH אנו מניחים שמרבית החלבונים נשטפים החוצה מלבד הליזוזים אשר קשורים לשרפים. כעת אנו נרצה לשחרר את הליזוזים, לשם כך נצטרך לשנות את מטענם לניטרלי או שלילי. מטרת הבופר קרבונט הוא להעלות את רמת הPH כדי שהליזוזים יהפכו ניטרלים/ שליליים ויתנתקו מהשרפים החוצה.

טבלה 2 – ריכוז החלבון במקטעים:
התמיסה A280nm  בליעה ריכוז החלבון מ"ג/מ"ל ריכוז החלבון  ב1 מ"ל מקטע מקורי -מ"ג/מ"ל תמיסת מוצא 1:20
1 .018
1 .538
3 0.76
תמיסת מוצא 1:40 0.555
0.823
3 2.92
מקטע טריס 1 – 1:10 0.172
0.232
2 .32
מקטע טריס 2
0.115
0.144
0.144
מקטע קרבונט 1
0.039
0.026
0.026
מקטע קרבונט 2
0.028
0.009
0.009
מקטע קרבונט 3
0.107
0.131
0.131
מקטע קרבונט 4
0.515
0.762
0.762
מקטע קרבונט 5
0.102
0.124
0.124
מקטע קרבונט 6
0.071
0.076
0.076
דוגמא לחישוב ריכוז החלבון:
תמיסת מוצא 1:20- –
טבלה 4 – פעילות ליזוזים במקטעים השונים:
המקטע המיהול הזמן לירידת 0.05
יחידות OD בשניות יחידות פעילות U – יחידות פעילות בתמיסה המקורית  מוכפל במיהול תמיסת מוצא
1 :20
3 6
2 .778
55.56
תמיסת מוצא
1 :40 53
1 .887
75.48
מקטע טריס 1
– ∞ 0 0 מקטע טריס 2
– ∞ 0 0 מקטע קרבונט 1
– ∞ 0 0 מקטע קרבונט 2
– ∞ 0 0 מקטע קרבונט 3
1 :2
8 8
1 .136
2 .27
מקטע קרבונט 4
1 :4
3 8
2 .631
1 0.53
מקטע קרבונט 5
1 :5
∞ 0 0 מקטע קרבונט 6
1 :2
∞ 0 0 דוגמא לחישוב יחידות פעילות:
תמיסת מוצא 1:20 – תמיסת מוצא 1:40 –   דוגמא לחישוב יחידות פעילות בתמיסה המקורית:
תמיסת מוצא 1:20 – הכפלת יחידות הפעילות בפקטור המיהול.
2.778×20=55.56U תמיסת מוצא 1:40 –
1 .887×40=75.48U טבלה 5 – ריכוז תוצאות הניסוי:
המקטע ריכוז חלבון מ"ג/מ"ל C נפח התמיסה מ"ל V סה"כ חלבון מ"ג VxC יחידות פעילות במ"ל U סה"כ יחידות פעילות UxV פעילות ספציפית U/C דרגת ניקוי ניצולת תמיסת מוצא
3 1.48
5
1 57.4
6 5.52
3 27.6
2 .081
1
1 00% מקטע טריס 1
2 .32
4 0 92.8
0 0 0 0 0 מקטע טריס 2
0.144
4 0 5.76
0 0 0 0 0 מקטע קרבונט 1
0.026
1 0 0.26
0 0 0 0 0 מקטע קרבונט 2
0.009
1 0 0.09
0 0 0 0 0 מקטע קרבונט 3
0.131
1 0
1 .31
2 .27
2 2.7
1 7.328
8 .327
6 .93% מקטע קרבונט 4
0.762
1 0 7.62
1 0.53
1 05.3
1 3.819
6 .641
3 2.14% מקטע קרבונט 5
0.124
1 0
1 .24
0 0 0 0 0 מקטע קרבונט 6
0.076
1 0 0.76
0 0 0 0 0 ריכוז החלבון לקוח מהעמודה האחרונה בטבלה מספר 2.
יחידות הפעילות לקוחות מהעמודה האחרונה בטבלה מספר 4.
דוגמא לחישוב סה"כ חלבון:
תמיסת מוצא- V×C=5×31.48=157.4mg מקטע טריס 1- V×C=40×2.32=92.8mg דוגמא לחישוב סה"כ יחידות פעילות:
הכפלת נפח התמיסה ביחידות פעילות במ"ל.
תמיסת מוצא – U×V=65.52×5=327.6
מקטע טריס 1- U×V=0×40=0 דוגמא לחישוב פעילות ספציפית:
סה"כ יחידות פעילות לחלק לסה"כ החלבון.
תמיסת מוצא- מקטע טריס 1- דוגמא לחישוב דרגת ניקוי:
פעילות ספציפית של תמיסה אחרי שלב הניקוי לחלק לפעילות הספציפית של תמיסת המוצא.
תמיסת המוצא- מקטע טריס 1- דוגמא לחישוב ניצולת:
סה"כ יחידות פעילות אחרי שלב הניקוי לחלק לסה"כ יחידות פעילות בתמיסת המוצא – כפול 100.
תמיסת המוצא- מקטע טריס 1-                  דיון:
בניסוי זה השתמשנו בשיטת מחליף קטיונים לבידוד חלבון הליזוזים מתמיסת מוצא שהוכנה מחלבון ביצת תרנגולת.
במהלך הניסוי הזרמנו את התמיסה דרך עמודת CMC ואספנו דגימות שונות.
ציפינו למצוא בתמיסת המוצא כמות גדולה של חלבונים וביניהם גם הליזוזים בדרגת ניקוי נמוכה. לאחר מכן אספו 2 דגימות בופר טריס. בשלב זה הליזוזים שבתמיסת המוצא נקשרים לשרפים ואילו יתר החלבונים שהיו בתמיסת המוצא אמורים להמשיך ולזרום בקולונה עד יציאה ממנה.
בדגימה זו לא ציפינו למצוא ליזוזים כיוון ואלו קשורים כעת לשרפים. אכן ניתן לראות בתוצאות הניסוי כי מרבית החלבון יצא כבר בדגימה הראשונה (40 מ"ל). ריכוז החלבון שם גבוה ביחס לדגימות אשר באות אח"כ, מרבית החלבונים של תמיסת המוצא פשוט נשטפו ללא עיכוב משמעותי בקולונה. לעומת זאת כאשר אנו בוחנים את הפעילות האינזימתית של ליזוזים בדגימות אלו אנו רואים שהיא אפסית – כלומר אין שם ליזוזים. תוצאה זו תואמת את ההשערה המקורית שלנו- בPH הזה (8.2) הליזוזים נשארו קשורים בתוך הקולונה.
בשלב הבא הזרמנו תמיסת בופר קרבונט בPH 10.5. הציפיה היא שבPH זה ינתקו הליזוזים מהשרפים וישטפו החוצה. מאחר וכעת הקולונה מלאה בבופר טריס אנו צפינו שיקח זמן עד שכלל הבופר טריס יצא ויוחלף בבופר קרבונט, הPH ישתנה בעמודה והליזוזים ישתחררו ויספיקו לזרום עם הנוזל מטה (בכח הכבידה). אכן כאשר מסתכלים בתוצאות אנו למדים כי רק כעבור 3 דגימות של 10 מ"ל קרבונט ריכוז החלבון בדגימות החל לעלות באופן משמעותי עד לשיאו בדגימה ה4 וכמו כן גם פעילות אינזימתית של ליזוזים זיהינו רק בדגימות אלה. בדגימה ה5 כמות הליזוזים חזרה להיות אפסית וניתן להסיק שכל הליזוזים כבר השתחרר עד אז מהשרפים ונשטף החוצה.
הדגימה הרביעית היא זו שיצאו בה מרבית הליזוזים והיא גם הדגימה הנקיה יותר.
ניתן לראות זאת מהפעילות הספציפית בדגימה זו, בדרגת הנקיון ובניצולת.
סה"כ ניתן להשוות בין ס"כ כמות החלבון של תמיסת המוצא לבין סכימת נתון זה ביתר הדגימות ולראות כי כמות החלבון הכללית יחסית קרובה משמעות הדבר היא שכל החלבון שנכנס לקולונה גם יצא ממנה או שיש טעות במדידות/חישובים. אני הייתי מצפה שכמות החלבון שתצא תהה קטנה מזו הנכנסת. הסיבה לכך היא איבודים שקורים בתהליך – חלבונים אשר נדבקים לכלים, חלבונים שעוברים בדרך דנטורציה מסיבות שונות וכו'.
אובדן זה שציפיתי לראות ניתן למצוא כאשר בוחנים את כמות הליזוזים – כשמשווים את סה"כ יחידות פעילות בתמיסת המוצא ובשתי תמיסות הקרבונט האחרונות בהן מצאנו ליזוזים ניתן לראות שנכנסו הרבה יותר ליזוזים מאשר יצאו. הדבר עולה בקנה אחד עם השערתי המקורית ואובדן זה הוא גם הסיבה לירידה בניצולת.
סיכום:
בניסוי זה רצינו לבודד את האנזים ליזוזים מתמיסת מוצא שמקורה בלובן של ביצת תרנגולת. עשינו זאת תוך שימוש במחליף קטונים על ידי ניצול התכונה הייחודית של הPI הגבוהה של הליזוזים. הצלחנו לבודד דגימה אחת עם פעילות אנזימתית טובה (דגימה מספר 4) דרגת הניקוי שלה הייתה 6.64 ועם ניצולת של כ32%.
שאלות מתוך חוברת המעבדה:
1.     השיירים שעשויים לגרום לPI הגבוה של הליזוזים הם שיירים של חומצות אמיניות בעלי pKa3 גבוה.
2.     לדעתי, מטענם של מרבית החלבונים המצויים בלובן של ביצה יהיו בpH 10.5
בעלי מטען שלילי משום שערכי הpI הסטנדרטיים הם בד"כ מתחת ל10.5. כאשר החלבון מצוי בpH שהוא מעל לערך הpI המטען הוא שלילי כיוון שהקבוצות האמיניות מסרו את הפרוטון והפכו לנייטרלים. אנחנו מצפים שהליזוזים ישאר בעל מטען חיובי כיוון שערכי הPI שלו גבוהים.
3.     א) כדי לקשור את הליזוזים למחליף קטיונים אנו צריכים שמטען הליזוזים יהיה חיובי – הם צריכים להימצא בpH  שהוא נמוך מהpI שלו – 10.5. מאחר ותחום הבופר של חלבון הוא פלוס מינוס 1 הייתי מנסה לקשור את הליזוזים בpH  שהוא קטן מ9.5 ובנוסף עלינו לוודא שערך הpH לא נמוך מידי (כלומר לא לרדת יותר מידי לתחומים בהם נמצאים ערכי pI של חלבונים אחרים) אחרת יהיו חלבונים נוספים בעלי מטען חיובי ולא נצליח לבודד רק את הליזוזים. לכן ננסה לקשור את הליזוזים ב8.2=PH.
ב) כן, עקרונית ניתן לבצע את קשירת הליזוזים למחליף קטיונים בכל ערכי הpH שקטנים מערכי הpI שלו, אך לא בכל PH נצליח לבודד אותו מחלבונים אחרים.
ג) אכן ניתן לקשור ליזוזים למחליף אניונים. כדי לבצע זאת על הליזוזים להיות בעלי מטען שלילי – כלומר pH>pI (מעל 10.5). עדיף pH שגדול מ11.5 (בופר של ±1). במקרה כזה יקשרו הליזוזים למחליף האניונים אך גם כל שאר החלבונים ולא ניתן יהיה לבודד את הליזוזים.
4.     א) תמיסת המוצא – מכילה את כלל החלבונים אשר נמצאים בלובן של ביצה (כולל ליזוזים  ועוד סוגים נוספים).
    ב) במקטעי טריס 1 + 2 – נצפה למצוא שם את כל סוי החלבונים הנמצאים בלובן הביצה מלבד חלבוני הליזוזים.
    ג) מקטעי קרבונט – בדגימות הראשונות תמצא כמות קטנה מאוד של חלבונים שהם לא ליזוזים (אם בכלל). לאחר מכן יתחלו להופיע ליזוזים בדגימות.
5.     תמיסת חלבון בולעת קרינה באורך גל של 280nm בגלל חומצות אמיניות בעלות שיירים ארומטיים. בחומצות אלה קיים אלקטרון אשר בדיוק באורך הגל הזה הוא מתערער ועולה לרמת אנרגיה הבאה.
6.     לדעתי, צריך להוריד את ערך הpH ל6.3 (מ10.5) משום שבשלב זה אנו רוצים לבחון את הפעילות האינזימתית כאינדיקציה להמצאות ליזוזים בדגימה ואנו רוצים ליצור יציבות עד כמה שניתן. שאלות לסיכום הניסוי:
1.     שיטות נוספות בהן ניתן להשתמש לבידוד האינזים ליזוזים:
           א.        בשל גודלו הקטן יחסית של הליזוזים ניתן להשתמש גם בכרומטוגרפיה על פי גודל – השרפים בנויים ממחילות קטנות אשר מאפשרות לחלבונים קטנים לעבור דרכן אך לא לחלבונים גדולים. החלבונים הגדולים עוברים בצידי המחילות בדרך קצרה יותר ויוצאים ראשונים מהקולונה בעוד שהחלבונים הקטנים מבצעים מסלול ארוך יותר דרך המחילות ויוצאים מאוחר יותר מהקולונה.
           ב.         אלקטרופורזה בג'ל (הרצה בשדה חשמלי) – מהירות הנדידה של החלבון היא ביחס ישר להפרש בין הpH לערך הpI של החלבון וביחס הפוך למשקלו. אם רוצים לבודד את אלמנטנ המטען ניתן להוסיף SDS (גורם דנטורציה) אשר "מעמיס" על החלבון מטענים שליליים ובכך מטעני החלבונים שלילים והם ינועו לאלקטרודה החיובית, ההבדל בינהם יהיה בשל גודלם.
2 .     הקביעה שדרגת ניקוי גבוהה של חלבון מצביעה על כך שכמות החלבון המנוקה במקטע הנקי גדולה בהרבה מכמותו בתמיסת המוצא לא נכונה.
כמות החלבון המנוקה תהיה גבוהה יותר בתמיסת המוצא מאשר במקטע המנוקה (בעקבות איבודים)
3 .     כל דגימה שלנו היא בעל נפח שונה, אנחנו לא רוצים שמסקנות הניסוי יושפעו מאופן לקיחת המדידה שלנו. לכן עלינו לנרמל את סך כל יחידות הפעילות לסך כמות החלבון שיש בכל דגימה. כך אנו מקבלים נתון של יחידות פעילות לריכוז ובעצם מבטלים את חשיבותו של נפח הדגימה ומקטינים את הסיכוי לשגיאות מדידה.
4.     בניסוי שלנו לא מצאנו כלל פעילות של ליוזים במקטעי הטריס. במדיה וכן היינו מוצאים ניתן היה להסביר זאת בכך שיתכן ותמיסת המוצא זרמה בקצב מהיר מידי במורד הקולונה ולא כל הליזוזים הספיקו להיקשר לrasins שבשרפים.